Analisa Carotenoid dalam Yeast dengan HPLC

Analisa carotenoid memang cukup sulit. Terlebih bila ingin melihat profile carotenoid apa yang terdapat dalam suatu sample. Sample yang saya hadapi adalah yeast jenis Phaffia. Pertama kali yang harus dilakukan adalah mengekstrak caroteoid. Solvent yang digunakan harus mampu untuk mengekstrak semua jenis carotenoid. B-carotene, Astaxanthin, Zeaxanthin, Lycopene, dan lainnya. Ini salah satu hal yang cukup menyulitkan. Karena biasanya solvent digunakan hanya untuk mengekstrak satu jenis carotenoid. Katakanlah B-caroten saja. Atau Astaxanthin saja.

Tapi karena tujuan saya adalah mengetahui carotenoid apa saja yang terkandung dalam suatu yeast, maka solvent yang digunakan harus mampu untuk mengambil semua carotenoid.

Setelah keluar masuk berbagai situs kimia, biokimia, mikrobiologi, dan lainnya, akhirnya saya menemukan journal tentang analisa total carotenoid dari Spirulina (salah satu jenis alga) menggunakan metode spectrofotometri. Dari sini lantas saya kembangkan agar aplicable dengan HPLC.

Pertama-tama sel yeast dipecahkan dengan DMSO agar carotenoid yang tersekap di dalam sel dapat keluar. Kemudian diekstrak dengan pelarut methanol hingga semua carotenoid terambil. Yang agak merepotkan adalah karena carotenoid sangat peka terhadap cahaya dan panas, maka selama pekerjaan sebisa mungkin tidak terekspos langsung oleh cahaya. Pengerjaan dilakukan di dark room. Carotenoid terdapat dalam bentuk esternya, metil ester atau di metil ester. Oleh karena itu perlu treatment khusus agar carotenoid menjadi bentuk bebasnya. Hal ini dilakukan dengan penambahan larutan KOH jenuh. Baru kemudian carotenoid dalam bentuk bebas ini di ekstrak dengan penambahan dietileter. Pelarut diuapkan dengan gas nitrogen dan dilarutkan kembali dalam fasa mobil yang akan digunakan untuk HPLC.

Hal lain yang perlu diperhatikan adalah ketersediaan standard. Sangat sulit mendapatkan standard carotenoid. Selain itu harganya betul-betul luar biasa. Terutama untuk carotenoid yang tidak begitu umum, seperti Lycopene dan Zeaxanthin. Harganya bisa mencapai belasan juta per mg. Bayangkan.. hanya per mg. Karena pertimbangan ini pulalah kemaren saya tidak menggunakan Lycopene dan Zeaxanthine, saya hanya menggunakan standard B-caroten dan Astaxanthin meskipun lycopene dan zeaxanthine tersedia. Toh masih tahap trial.

Penentuan sistem HPLC juga lumayan sulit. Saya khusus mencari metode yang menggunakan C18 sebagai column. Memang ada beberapa metode yang menggunakan C18, namun dengan fase mobil yang berbeda. Saya putuskan untuk menggunakan fasa mobil campuran acetonitril dan methanol dengan sistem isokratik, dengan pertimbangan ini adalah pelarut yang umum dan mudah ditemukan.

Hasil trial kemaren, dengan sistem isokratik dan flow 0.5 ml/min, Astaxanthin lebih dulu terelusi. Bahkan sangat awal, hampir dekat dengan peak pelarut. Sebaliknya B-carotene lebih lama, keluar pada menit ke 45. Signal sample menunjukkan terdapat B-carotene namun tidak untuk Astaxanthin. Saya masih belum pasti. Apakah tidak adanya peak Astaxanthin betul-betul karena sample tidak mengandung carotenoid jenis ini, ataukah karena saat preparasi sample Astaxanthine tidak ikut terekstrak.

Namun setelah saya rubah metode preparasi dengan mengurangi tahapan dan hanya menggunakan DMSO tanpa ada proses saponifikasi dengan KOH, hasil yang di dapat juga tidak mengantarkan pada kesimpulan yang pasti. Signal betul-betul berbeda dengan signal pertama, bahkan pada signal kedua tidak terdapat peak B-caroten atau Astaxanthin. Jadi saya simpulkan bahwa preparasi yang pertama yang labih akurat. Namun tentu saja masih perlu dilakukan study lebih jauh.

Fiuuhh.. sebetulnya saya ingin bertanya tentang hal ini. Terutama metode ekstraksi carotenoid dalam yeast. Tapi tanya ke siapa ya??