Performa Carbohydrate Column Turun..

Hmm.. ada sedikit hal yang menarik dan mungkin sedikit menggangu pada perkerjaan saya saat ini. Salah satu tugas saya adalah melakukan kegiatan analisa kimia. Diantaranya adalah analisa kandungan gula dengan HPLC (High Performance Liquid Chromatography).

Kemaren ketika saya melakukan analisa untuk mengetahui profile gula dalam sample hasil fermentasi, saya dapatkan bahwa performance column yang saya gunakan, Agilent carbohydrate column, menurun. Fructose dan sucrose tidak dapat terpisah sempurna. padahal pada awal-awal pemakaian, resolusi fructose dan glucose sangat bagus. Bahkan glucose dan mannose yang terkenal sangat sulit untuk dipisahkan-pun dapat terpisah meski sedikit berimpit overlap.

Tidak hanya itu saja, saya perhatikan, RT juga bergeser. Elusi semua zat menjadi lebih cepat. Padahal semua sistem dan kondisi HPLC sama persis. Sebagai contoh, RT untuk sucrose yang apa awalnya 12 menit, pelan-pelan bergeser menjadi 8 menit, sekarang bahkan kurang dari 5 menit. Saya tidak tahu apakah tipical dari column ini memang demikian. Signal yang diperoleh kurang reproducible seiring banyaknya pemakaian, meskipun semua sistem yang dipakai sama. Memang saya mengerti semakin banyak dipakai, performa column akan semakin menurun. Tapi untuk kasus ini umur column masih terbilang muda, baru satu tahun. Dan frekuensi pemakaianpun jarang. Kalau saya hitung-hitung, total injek sample selama ini sekitar 250 injek. Saya juga selalu menyiapkan sample sesuai dengan prosedur preparasi standard. Filtrasi, purifikasi menggunakan sep-pack cartridge, menggunakan guard column, pokoknya semua usaha preparasi sample dan maintenance alat.

Kemaren saya terpaksa trial lagi untuk mencari kondisi sistem terbaik agar performa column dapat kembali optimal. Namun sepertinya kurang berhasil. Fructose dan glucose masih tetap saling overlap.

Oh iya, sebagai informasi. Untuk analisa sugar, saya menggunakan detektor RI. Dan salah satu kelemahan detektor ini adalah tidak bisa digunakan untuk sistem fasa mobil gradient. Jadi harus isochratic. Ditambah lagi bila menggunakan fasa mobil campuran, misalnya campuran acetonitril dan air, usahakan pencampuran antara keduanya betul-betul sempurna. Karena hal ini berpengaruh pada base line. Biasanya saya mensiasati ini dengan mencampur fasa mobil di luar sistem HPLC, kemudian sonicator selama 30 menit agar campuran benar-benar homogen. Meskipun HPLC yang saya gunakan telah mempunyai kemampuan mencampur fasa mobil secara otomatis.Dan lagi limit deteksi untuk detektor ini lumayan besar. Saya harus melakukan pemekatan pada sample agar sugar dapat terdeteksi. LOQ untuk adalah 2 mg/ml. Besar kan.. biasanya saya buat standard minimal 5 mg/ml. Nah kendalanya kalau ingin analisa profile sugar dari mulai mono- sampai oligosakarida, standard tidak bisa labih dari 5 jenis sugar. Karena kalau lebih dari 5 jenis, dan masing2 konsentrasinya 5 mg/ml, bisa jenuh larutannya.

Fiuh.. rencananya hari ini saya mau tanyakan ke pihak suplier tentang kondisi column. Apakah carbohydrate column memang seperti itu, dan bisa tidak-nya usaha mengembalikan kemampuan separasi dari column seperti semula.