Prinsip Dasar Spektrofotometer Visible

Dalam dunia analisis kimia dikenal suatu alat yang bernama Spektrofotometer visible. Alat ini berdasar hukum Lambert-beer.

“Jumlah radiasi yang diserap proporsional dengan ketebalan sel (b), konsentrasi analit (c), dan koefisien absorptivitas molekuler (a) dari suatu spesi (senyawa) pada suatu panjang gelombang”

Kalimat di atas terlihat sulit untuk dipahami. Dan memang sulit. Biasanya orang tidak mudah untuk mencermati dan memahami tiap kalimat pada hukum Lambert-beer (LB). Belum lagi istilah-istilah yang asing dan tidak biasa bagi kebanyakan orang. Plus persamaan-persamaan yang rumit dan njelimet.

Pada artikel kali ini saya akan menjelaskan sesederhana mungkin. Keluar dari belenggu teoritis dan matematis. Saya menitikberatkan pada prinsip aplikasi alat spektrofotometer ketimbang dasar teori yang melandasi. Istilah asing seperti ‘koefisien absorptivitas molar’, formula hubungan ketebalan media dengan intensitas sinar, tidak akan saya jelaskan detail. Saya mencoba menjelaskan secara sederhana prinsip dasar dari alat spektrofotometer visible (spektro-vis).

Logika prinsip dari alat spektro-vis adalah intensitas warna dari suatu larutan sebanding dengan jumlah cahaya yang serap. Semakin pekat warna, semakin banyak cahaya yang di serap.

Sekarang anda bayangkan sebuah gelas. Gelas tersebut di isi dengan air mineral yang jernih. Kemudian anda lewatkan seberkas sinar melalui gelas tersebut, misalnya dengan lampu senter. Cahaya sinar lampu senter akan lewat dengan mudah bukan..? menembus melalui gelas.

Sekarang coba anda ganti isi air mineral dengan air sirup yang berwarna, katakanlah coklat (sirup rasa coklat). Sekarang coba anda lewatkan cahaya lampu senter melalui gelas tersebut. Apa yang terjadi..? Sinar sulit melewati air sirup berwarna. Memang ada yang lewat, tapi tidak semuanya. Sebagian sinar ada yang di serap oleh warna coklat sirup.

Semakin pekat warna pada sirup, sinar lampu senter akan semakin sedikit yang menembus gelas. Dengan kata lain semakin banyak cahaya yang diserap. Jumlah cahaya yang di serap berbanding lurus dengan intensitas warna. Hal inilah yang mendasari pengukuran spektro-vis.

Pengukuran kuantitatif

Apabila anda mempunyai larutan dengan deret warna yang semakin pekat. Kemudian anda mengukur absorbasinya (jumlah cahaya yang diserap). Maka akan didapatkan suatu kurva linier. Jumlah cahaya yang diserap semakin banyak seiring dengan intensitas warna yang semakin pekat. Deret warna ini dalam dunia analisis kimia di sebut sebagai deret standar. Dan jika suatu larutan telah diketahui absorbansinya, maka konsentrasinya-pun dapat diketahui dengan membandingkan terhadap deret standar. Inilah prinsip dasar pengukuran konsentrasi menggunakan spektro-vis.


Limitasi dalam Spketro-Vis

Beberapa hal yang perlu diperhatikan adalah. Pada konsentrasi yang terlalu pekat, kurva deret standar menjadi tidak linier. Biasanya konsentrasi di atas 0.1 M. Hal ini karena pada konsentrasi yang tinggi, jarak antar partikel zat menjadi sangat rapat. Hal ini akan mempengaruhi distribusi muatan, dan mengubah cara molekul melakukan serapan. Oleh karena itu terkadang pada konsentrasi terlalu tinggi kurva tidak linier. Itulah sebabnya pada pembuatan deret standar, absorbansi dianjurkan tidak melebih 1. Jadi absorbansi deret standar ada di dalam range 0-1.


Perbedaan kuvet sangat berpengaruh. Harap selalu gunakan satu kuvet yang sama untuk mengukur absorbansi. Apabila anda terlibat dengan sample yang jumlahnya banyak, dan anda menggunakan kuvet disposable, gunakan kuvet maksimal tiga kali pemakaian. Setelah itu pakai kuvet baru.

Terkadang senyawa analat mengalami reaksi kimia yang lambat dan memerlukan waktu untuk mencapai kesetimbangan. Hal ini menyebabkan penyimpangan yang signifikan bila pembacaan absorbansi tidak dilakukan bersamaan.

Lakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang maksimal. Jangan sungkan untuk mencari terlebih dulu pada panjang gelombang berapa sample memberikan absorbansi maksimal. Hal ini untuk meningkatkan sensitifitas analisa.