Identifikasi signal kromatogram HPLC

Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan proses analisa.

Yang berperan dalam proses separasi pada system HPLC adalah kolom. Ada kolom yang digunakan untuk beberapa jenis analisa, misalnya kolom C18 yang dapat digunakan untuk analisa carotenoid, protein, lovastatin, dan sebagainya. Namun ada juga kolom yang khusus dibuat untuk tujuan analisa tertentu, seperti kolom Zorbax carbohydrat (Agilent) yang khusus digunakan untuk analisa karbohidrat (mono-, di-, polysakarida). Keberhasilan proses separasi sangat dipengaruhi oleh pemilihan jenis kolom dan juga fasa mobil.

Setelah komponen dalam sample berhasil dipisahkan, tahap selanjutnya adalah proses identifikasi. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample.

Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis. Sample farmasi biasanya jauh lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.

Contoh kromatogram dengan banyak peak

Kesulitan biasanya dihadapi ketika akan mengidentifikasi suatu kromatogram yang terdiri atas banyak peak. Untuk mengetahui peak mana yang merupakan milik analat (zat target analisa) kromatogram dibandingkan dengan kromatogram standard. Nah disinilah kadang analis sedikit ceroboh. Cara yang paling umum untuk mengidentifikasi adalah dengan melihat Retention time (RT). Peak yang mempunyai RT yang sama dengan standard umumnya akan langsung di vonis sebagai peak milik analat. Memang senyawa/zat yang sama akan mempunyai RT yang juga sama, dengan catatan sample dan standard dijalankan dengan kondisi dan sistem HPLC yang sama. Namun bukan berarti RT yang sama pasti merupakan zat/senyawa yang sama. Disinilah para analis biasanya terkecoh.

Saya pernah mengalami hal ini. Ketika bermaksud ingin melihat kandungan Lovastatin dalam suatu sample hasil fermentasi dari Monascus, sejenis fungi, Kromatogram yang saya peroleh mengandung banyak peak yang membuat saya kesulitan untuk menentukan yang manakah dari peak-peak tersebut yang merupakan peak milik Lovastatin. Setelah jalan standard Lovastatin, saya temukan satu peak pada sample yang memilki RT yang sama dengan peak pada Standard. Awalnya saya mengira bila peak tersebut adalah peak Lovastatin, sehingga dari sini saya menyimpulkan bahwa sample yang saya analisa betul mengandung Lovastatin. Namun setelah saya bandingkan spektrum 3D untuk kedua peak, ternyata keduanya memilki spektrum 3D yang berbeda. Sehingga meskipun peak tersebut keluar pada RT yang sama dengan standard Lovastatin, namun itu bukanlah Lovastatin karena spektrum 3D berbeda dengan spektrum Lovastatin.

Jadi, melihat RT sebetulnya belumlah cukup untuk mengidentifikasi suatu zat. Hal lain yang perlu dilihat adalah spektrum 3D dari signal kromatogram. Zat yang sama akan mempunyai spektrum 3D yang juga sama. Sehingga jika spektrum 3D antara dua zat berbeda, maka kedua zat tersebut juga dipastikan adalah zat yang berlainan, meskipun memiliki RT yang sama.

Lantas bagaimana bila sistem HLC yang digunakan tidak dapat memunculkan spektrum 3D?
Spektrum 3D hanya dapat ditampilkan oleh HPLC yang telah menggunakan DAD (Diode Array Detector) sebagai detektor. Sedangkan HPLC yang masih menggunakan detektor UV tidak dapat melihat spektrum 3D. Namun, konfirmasi masih dapat dilakukan dengan melihat spektrum UV. Prinsipnya sama. Jika spektrum UV kedunya sama, maka keduanya adalah zat yang sama. Tapi jika spektrum UV sample berbeda dengan standard, maka keduanya zat yang berbeda sekalipun memiliki RT yang sama.